登上Science专刊的CRISPR技术究竟是啥？

作者：李辉（中国科学院青岛生物能源与过程研究所）

文章来源于科学大院公众号（ID：kexuedayuan）

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2018年8月31日，著名的学术期刊Science推出了“技术转化生物学专刊”，介绍了几种革命性的生物技术，其中一种就是基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术。

（图片来源：网络）

CRISPR技术的来头可不简单，今年上半年，36岁的华人学者张锋教授当选美国文理科学院和美国科学院院士。他的主要贡献之一就是将一种免疫系统CRISPR-Cas开发成基因编辑工具，而之前CRISPR技术也曾分别在2013年和2015年入选SCIENCE杂志评选的年度十大科技进展。 今天大院er就让你迅速看懂传说中的CRISPR技术！

CRISPR-Cas系统是何方神圣

它是在细菌和古菌中广泛存在的一种获得性免疫系统，被细菌和古菌当作抵抗病毒和外源质粒的杀手锏之一。

它由两部分结构组成，第一部分是CRISPR位点，CRISPR位点中存贮着宿主曾经消灭过的病毒或者外源质粒的特征序列，第二部分是表达CRISPR相关蛋白（CRISPR相关的英文缩写为Cas）的基因，CRISPR相关蛋白就是CRISPR-Cas系统的“杀器”，一般具有核酸酶活性，能够降解DNA。

CRISPR-Cas系统对抗并消灭病毒和外源质粒的过程可以分成三个阶段，分别是试探（外源DNA的获取）、破招（CRISPR RNA的加工）和制胜（gRNA介导的降解）。

试探：在这个阶段，CRISPR-Cas系统从初次入侵的病毒和质粒中选取一段特异的DNA序列（spacer）插入到自身的CRISPR位点，算是掌握了侵入病毒和外源质粒的特点，拥有了对抗他们的能力。

破招：第二个阶段发生在同样的病毒和外源质粒再次侵入时，这时含有前一阶段所获取的spacer的CRISPR位点被转录，转录产物进一步被加工成成熟的gRNA（指导RNA），这些gRNA的产生是能够最终消灭掉入侵的病毒或外源质粒的关键，它们可以指导Cas蛋白靶向到相应的病毒或质粒。

制胜：这个阶段，Cas蛋白开始起作用，它会利用它的核酸酶活性在gRNA 介导Cas蛋白靶向到目的病毒或质粒后，把病毒和质粒进行降解，降解完成后， CRISPR-Cas系统在和病毒及外源质粒的较量中就取得了胜利。

CRISPR-Cas9是CRISPR-Cas系统中的一种，目前基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术是同类型技术中应用最广泛的一种。如果要把CRISPR-Cas9开发成基因编辑工具，我们需要设计能够介导Cas9蛋白靶向到目标DNA的gRNA ，此外还需要提供和被编辑位点两端序列一致，中间含有序列被修改过的供体DNA，这样以来在Cas9蛋白将目标DNA切割后，供体DNA便可以和目标位点发生重组，从而对目标位点完成编辑。

CRISPR技术 强在哪里？

和传统的基因编辑技术相比，CRISPR具有诸多的优势。

CRISPR基因编辑技术大大缩短了对目的基因编辑的时间。在CRISPR基因编辑发明之前，要拿到一个满足需求的转基因小鼠需要一个博士后一年的时间，而使用这项技术在标准化的流程下需要的时间可以减少到一个月。

CRISPR基因编辑技术同时也大大降低了基因编辑的成本。之前，利用基于锌指酶的基因编辑技术来编辑人体内一个编码网格蛋白的基因时，每个能够靶向特定序列的锌指酶需要花费25000美元，而利用CRISRP基因编辑技术，相应的序列和酶只需要数十美元。

CRISPR的高效率使得对多个位点同时进行编辑的可能性大大增加。利用传统的基因编辑技术一般只能对单个位点进行编辑，而目前利用基于CRISPR-Cas9的基因编辑在真核生物中最多可以对7个位点同时进行编辑，而另外一种类型的CRISRP系统CRISPR-Cpf1，相应的位点是4个。

CRISPR对目的位点强大的切割能力为它赢得了“基因魔剪”的美誉，而如果把Cas9蛋白的或者经过改造后的Cas9蛋白和其它具有其它功能的蛋白联用，CRISPR所能实现的功能就更多了，包括外源基因的敲入、内源基因的敲除、敲降、对基因组DNA进行表观修饰和对单碱基进行编辑等等，所以用“遗传军刀”去类比它可能更加合适。

适用范围广也是这个技术一个非常突出的特点，自2012年CRISPR被证明能改造成基因编辑工具之后， 2013年MIT的张锋教授和哈佛大学的George Church教授迅速将其用于人体细胞的编辑。随后，CRISPR基因编辑技术也被成功的证明可以用于小鼠、斑马鱼、大鼠、果蝇、线虫、拟南芥、粗糙脉胞菌、食蟹猴、兔子、猪、山羊和人等物种的基因组编辑。

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CRISPR应用之一：消灭疟疾

疟疾每年造成超过50万人死亡，其病原体由蚊子携带。如果能够降低蚊子的生殖能力，也就能够消灭疟疾了。在这个过程中CRISPR-Cas9系统也可以大显身手。

基因驱动技术是一种能够将特定性状在一个种群中快速传播的技术，这个功能的实现依赖于一种“自私”的基因，这类基因的产物一般是位点特异性的核酸内切酶，能够切割同源染色体上与其位置相同的序列，之后以自身为模板，对被切割的序列进行修复，使得同源染色体上相应的序列和自己相同，从而增加了自身序列被传递到子代的概率。如果把相应的基因驱动系统放置到能够导致蚊子雌性不育的基因之内，那么雌性不育这一性状就会在种群中快速传播，最终子代蚊子形成的种群中的性别会失衡，蚊子数量会下降，也就间接地达到了消灭疟疾的效果。

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CRISPR-Cas9对目标位点准确、高效地切割能力以及CRISPR-Cas9可以被改造成“自私”的基因这两个特点使得消灭蚊子成为可能。由CRISPR-Cas9衍生的基因驱动系统由两个部分组成，一是含有能够靶向同源染色体上和基因驱动系统处于相同位置的gRNA，二是Cas9蛋白的编码基因。拥有了gRNA和Cas9蛋白，可以在同源染色体上相应的位置进行切割，染色体被切割后有两种结果，一是如上所述以含有基因驱动系统的染色体为模板进行重组，我们最终得到雌性不育的蚊子，另一种未能发生基因重组的蚊子则会直接死掉。这样以来，雌性不育的性状就在种群中传播开来了。

农业、生态、医学……CRISPR都能干！

微生物的一些代谢物可以被应用于能源、化工和健康等行业，比如乙醇可以作为燃料，乙烯可以作为合成纤维或橡胶的原料，甘油葡萄糖苷可以作为化妆品的添加剂，因此微生物相当于一座细胞工厂！尽管已经有可以对微生物基因组进行编辑的工具，但是CRISPR的出现可以让人们更方便地改造微生物。

CRISPR基因编辑技术在农作物的改良方面有广泛的应用空间，目前全球最大的种子和农药公司杜邦公司已经开始利用CRISPR基因编辑来对玉米和大豆进行改良，改良的性状包括耐旱，提高种子的含油量以及耐除草剂等。

再生已灭绝物种是否有意义虽然存在争议，但是也有科学家正在继续研究，在2012年哈佛大学一个由George Church教授领导的团队就宣称要通过克隆和基因编辑技术来复活猛犸，他们所用到的基因编辑技术就是CRISPR技术。

在医学上， CIRSPR基因编辑技术的应用也令人振奋。源于CRISPR基因编辑的单碱基编辑技术可能治愈上万种由单碱基突变引起的遗传疾病。另外，根据最近在Nature Communication发表的一项研究，科学家门已经可以利用基于CRISPR的CRISPR激活（CRISPR activation）技术成功的将人类的皮肤成纤维细胞诱导成了诱导型多能干细胞。

一个视频，了解“上帝的剪刀”

当然，它也是一把双刃剑

不过，就像很多高新技术一样，CRISPR在应用上也存在隐患，需要在使用中进行监管。

从技术层面上来看，是否存在脱靶效应一直存在着争议，也就是说在编辑目的基因时可能会对其它不期望编辑的位点也进行编辑。最近发表在《Nature biotechnology》上的一项研究报告说，利用CRISPR编辑老鼠胚胎干细胞、造血干细胞和人类分化的细胞系时靶标位点也存在明显的突变，包括大片段的删除以及复杂的基因组重组，而这些突变可能致病。

另外，发表在《Nature medicine》上的一项研究声称，利用CRISPR对人类多能干细胞进行编辑时，发现CRISPR引起的双链断裂能够引起p53介导的DNA损伤响应，而基因编辑的效率与损伤响应是相冲突的，要想提高编辑的效率需要抑制p53介导的损伤响应，但它被抑制后会增加CRISPR脱靶的概率以及罹患癌症的风险。

从社会规范的角度上看，目前已经有不少的黑客在网络上直播利用CRISPR对自己进行基因编辑，这种做法会对公众产生误导，缺乏足够相关知识的人员盲目效仿可能会对安全造成伤害。

少数人利用CRISPR对自己进行基因编辑（切勿效仿！ 图片来源：网络）

另外从国家安全的角度上来看，各国政府也在关注这项技术的发展，由于CRISPR基因编辑的低成本以及操作简单，2016年美国一个国立智库在向美国参议院提交的一份报告中甚至建议将CRISPR基因编辑技术和朝鲜核试及叙利亚化武一同列到大规模杀伤性武器的名单中。

结语

CRISPR-Cas系统的多样性是其宿主和病毒及外源质粒长期角力的必然的结果。截至目前，发现的CRISPR-Cas系统已经多达6类，19种亚型。这些不同类型的免疫系统每次“转身”所衍生出的新技术都有巨大的潜力。在未来，除了充分利用已经开发的技术，进一步发现新型CRISPR-Cas系统、将CRISPR-Cas系统改造成更多的技术以及如何对其进行监管和引导都是人们应该努力的方向。

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