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关于测血糖法的十年之争——藏在Folin-Wu法背后的“秘史”

时间：2022-08-31 16:43:33 来源：科普之家作者：协和医学杂志栏目：人物阅读：159

作者：杜海琳谷晓阳

学医的同学们应该都很熟悉一个生化实验，即“用Folin-Wu法测定血液中葡萄糖含量”。顾名思义，Folin-Wu法是由美国生化学家奥托·福林（Otto Folin）和我国生化学家吴宪发明的。然而，在这项发明的背后，还隐藏着一段不为人知的“争斗史”。

在科学史上，科学家们相互竞争的例子并不少见，比如微生物学的奠基人巴斯德和科赫，数学及物理界的翘楚牛顿和莱布尼茨，他们有的竞争上升到了祖国荣誉，有的甚至导致了私人关系极度恶化。

在生物化学史上，也有这样两位科学家，他们围绕着一个看似“微小”的主题你来我往，热火朝天地争论了十年之久，临床血液生化检测的历史，也因之改变。同时，在他们的竞争中还培养出了一位中国化学界的巨匠——吴宪。

1 福林与本尼迪克特其人

故事的第一位主角是奥托·福林（图1）。福林是20世纪美国生化学史上最著名的生化学家之一，也被称为美国第一个临床生化学家。

图1 奥托·福林（Otto Folin）

1867年他出生在瑞典南部，1892年获得明尼苏达大学学位后，进入芝加哥大学攻读有机化学专业的研究生。此时欧洲的生理化学（physiological chemistry）领域正蓬勃发展，福林决定前往欧洲学习此方面的知识。

1897—1898年，福林先后跟随德国生化学家恩斯特·萨尔科夫斯（Ernst Salkowski）、阿尔布雷希特·科塞尔 (Albrecht Kossel)学习。他在德国了解了用于酿酒业的比色新技术，掌握了最新版比色计的用法，这成为其后来设计生化检测中比色方法的基础。

1898年，福林返回芝加哥获得了博士学位。

1904年，福林就职于麦克莱恩医院（McLean Hospital）期间，提出可以使用简单比色法（simple colorimetric method）定量测定尿中肌酐的含量。他利用尿肌酐与碱性环境中的苦味酸离子在室温下反应变红的性质，将尿肌酐的量与红色的深浅建立相关性，再用比色计比较颜色的深浅度，从而得出较为准确的定量结果。

1905年，福林在《美国生理学杂志》（Am J Physiol）接连发表3篇文章，描述了尿液中尿素、肌酸、肌酐和尿酸等物质的分析方法，这些文章及其中分析方法的日益普及为福林赢得了巨大学术声誉，帮他一举拿下了许多人梦寐以求的教职。

1907年，福林被哈佛大学任命为生化系教授，并于1909年成为系主任。

而故事的另一位主角斯坦利·本尼迪克特（Stanley Benedict）（图2）也是临床血液生化史上的一位重要人物。

图2 斯坦利·本尼迪克特（Stanley Benedict）

1884年他出生于美国俄亥俄州，本科毕业于辛辛那提大学，之后于1906年考入耶鲁大学攻读生理化学方向的研究生。本尼迪克特读书期间，福林设计出了用少量的血液标本获得较高精度结果的血液分析方法。这些分析方法为临床医生提供了定量研究血液主要成分的机会。本尼迪克特大受启发，对这些方法进行了批判性研究，并在此基础上对福林这套分析方法加以改进。由此，本尼迪克特满怀热情地开启了他的研究生涯。

1908年，年仅24岁的本尼迪克特设计出了一种尿糖检测试剂，即现在为医学生所熟知的“本尼迪克特试剂”，其中包含硫酸铜、柠檬酸钠和碳酸钠。这种方法对尿中葡萄糖含量测定的敏感性显著高于其他方法，因此成为当时临床检测中应用最广的方法。

1910年，他成为了康奈尔大学医学院的教授。在接下来的几年里，每当福林研究出一种新的分析方法，本尼迪克特就会对其研究进行审视和批判，在一些重要细节上进行改进。福林所设计的尿酸、肌酸、肌酐、糖等的分析方法，在发表时是当时最好的方法，但短短几个月内，本尼迪克特就以各种方式对其进行了改进。

2 福林与本尼迪克特关于测血糖法的十年之争

20世纪初期，临床糖尿病学家呼吁发明更快速准确的血糖测定法。由此，福林和本尼迪克特也将研究的重点聚焦于如何准确地测量出血液中的糖含量。

1913年，本尼迪克特和生化学家罗伯特·刘易斯（Robert Lewis）共同发表了一篇使用苦味酸法估算少量血液中血糖含量的文章。文章指出，当葡萄糖与苦味酸、碳酸钠共热时溶液变红，可利用此显色反应进行比色，从而估计血液中葡萄糖的含量。随后几年，本尼迪克特及其团队在此基础上不断改进，发表了以改进版苦味酸法测定血糖和尿糖的一系列文章。

福林对血糖测定的探索也未曾停止。早在1912年，他阅读了一篇以磷钨和磷钼酸化合物作为显色剂的文章。此后便以此为基础开启了进一步研究。同年，福林及其助手、美国生化学家威利·丹尼丝（Willey Denis）共同研制出了一种用于测量血液中的非蛋白氮的Folin-Denis试剂，该试剂由钨酸钠、磷钼酸、磷酸组成。

在考察本尼迪克特的苦味酸测血糖法研究之后，福林思考：能否在此基础上，再作一些改进呢？

福林和他的博士生吴宪在多次实验后发现Folin-Denis试剂与苯酚混合后，可与氧化亚铜发生强烈而稳定的显色反应，这远比通过本尼迪克特法中苦味酸反应得到的颜色明显。而用于还原的溶液，是一种对微量糖极为敏感的碱性酒石酸铜试剂，不受肌酸或尿酸的影响。除此之外，为了进一步提高测量的准确度，福林与吴宪还研制出了一种钨酸滤血法来沉淀血液中的蛋白质。此过程无须加热，也不存在过量酸的加入，可产生接近于中性的滤液。如此，便可排除血液中蛋白的存在对试剂氧化还原反应的干扰，从而降低测量误差。这种滤过血液中蛋白质的方法可以说是临床生化研究发展的里程碑，其不仅可用于血糖测定，还可广泛应用于血液中肌酐、尿酸、非蛋白氮和氯化物等的测定。

福林和吴宪把自己的检测结果和苦味酸法测得的数值进行比较，认为“相较于现存的测血糖法，我们的方法最为准确”。1919年，该研究成果发表于《生物化学杂志》（J Biol Chem），其中对血糖含量的测定方法，便是著名的Folin-Wu法的雏形。

本尼迪克特密切关注着福林和吴宪的研究进展。二人的文章发表后不久，美国生化学家协会（American Association of Biological Chemists）年会召开。在此次会议上，本尼迪克特公开指出了Folin-Wu法的缺陷，“这种方法存在大量的、不可避免且不可控制的亚铜再氧化”，即在实验的过程中，铜离子被葡萄糖还原所生成的亚铜离子又会被空气中的氧气重新氧化成铜离子，使实际测得的亚铜离子量变少，导致血糖测定值不准确。

吴宪立刻着手解决本尼迪克特提出的问题。1920年，吴宪和福林在《生物化学杂志》上再次发文，文中对本尼迪克特的批评作出了详细回应。首先，他们承认在实验过程中的确存在亚铜再氧化现象，但指出该问题所造成的误差并不会太大。其次，针对再氧化问题，他们设计出了一种特殊试管（图3），如此可最大程度降低亚铜再氧化的发生，这种试管至今仍在生化实验中使用。他们还在文章中写道，“我们很感谢本尼迪克特先生，因为有您，我们得以重新审视自己的研究方法。”

图3

同时，吴宪还独立提出了Folin-Denis与苯酚混合试剂的改进版本，该试剂由磷酸、钨酸钠和钼酸组成，可在酸性环境下与亚铜离子反应。这使得Folin-Wu法得到了进一步完善，测得的血糖值更加准确。

1925年，本尼迪克特对改进后的Folin-Wu法又提出了新的批评。他提出了一种改良版的铜还原测血糖法——在碱性铜试剂中加入亚硫酸氢钠。当用此法测定血糖时，得到的结果数值明显低于Folin-Wu法，也就是说比Folin-Wu法更准确。此外，本尼迪克特还批评了Folin-Wu式血糖管。他认为，可以用普通的试管代替Folin-Wu式血糖管，只需用惰性气体取代试管内的空气，并用棉塞封闭试管口就可以得到同样的效果。

1926年，福林发表了《测定血液和正常尿液中糖含量》（The Determination of Sugar in Blood and in Normal Urine）一文，该文对Folin-Wu法的碱性酒石酸铜试剂改进方法进行描述，并反驳了本尼迪克特的看法。

福林指出，“铜试剂中碳酸钠的存在给铜还原反应营造了一种过强的碱性环境”，且葡萄糖在碱性溶液中性质不稳定，会与碱性试剂缓慢发生反应，由此他在原始试剂的基础上加入了碱性更弱的碳酸氢钠，组成了一种新型的弱碱性酒石酸铜试剂。这种测试方法的适用范围很广，可用来测定血糖和尿糖。同时，他在文章中提到，他重复了本尼迪克特的实验，认为没有证据能证明本尼迪克特新方法测得的血糖值低于Folin-Wu法，且本尼迪克特改进时使用的亚硫酸氢盐性质不稳定，会自发氧化成硫酸盐。而关于Folin-Wu式血糖管，福林写道，“我们试验过本尼迪克特提出的方法，但并没有效果，因此才设计出了Folin-Wu式血糖管。”

面对福林的回应，本尼迪克特承认亚硫酸氢盐的不稳定性，他表示，“很抱歉在这点上犯错误”，但接着又指出了福林这篇新文章中的错误——改良版铜试剂无法用于测定尿糖含量。本尼迪克特将定量的葡萄糖加入尿液中，并应用福林改进后的Folin-Wu法测定尿糖，“添加的40 mg葡萄糖中损失了约25%。显然，改进后的Folin-Wu法不适用于尿液中糖含量的测定。”福林也最终屈服并接受了本尼迪克特的批评，认可“以此种方法测量尿糖含量误差很大。”

至此，福林和本尼迪克特围绕测血糖法持续了近10年的争论终于落下帷幕。在双方不断的切磋交流中，Folin-Wu法也在不断完善，成为了如今我们熟知的血糖测定方法。

3 竞争虽在，友谊长存

福林和本尼迪克特在学术上的长期争斗不但没有造成私人关系的恶化，反而加深了他们对彼此的敬意。面对本尼迪克特对自己方法的不断批评与修正，福林一直怀揣着包容的态度，并和本尼迪克特保持着有好的关系。

有一年夏天，福林甚至将自己的私人实验室交给本尼迪克特使用。福林去世后，本尼迪克特在给朋友的一封信中写道：“福林有着让我十分敬佩的品质，当遇到涉及科学领域的分歧时，他能放下个性和情绪，这在科学研究中是极为罕见的。我认识的所有人中，没有人能如我俩这般在有着激烈学术分歧的同时，还保持着25年不变的亲密友谊。”

而他们的竞争也给彼此的工作带来了提升。本尼迪克特以批判性眼光一次次检视福林的研究成果，促使福林不断探索创新。福林的“反击”也不断把本尼迪克特的研究推向新的高度。1932年，由于福林和本尼迪克特在血液和尿液分析领域的杰出贡献，二人均获得了诺贝尔生理学或医学奖提名（图4）。

图4

其实在科研过程中，研究者们可能更关注与自己预设结论相近的实验结果。而学术竞争的存在便可纠正这种由研究者个人认知所造成的偏差。尽管科学家潜意识里可能不愿反驳自己的想法，但他们的竞争对手却乐于为之。取人之长，补己之短。如此，才能不断突破自己思考及研究的局限性，完善自己的研究。正如Folin-Wu法的诞生与完善，有福林及吴宪研究的贡献，也有着本尼迪克特不断检验与批评的贡献。

4 中国生化学界的巨匠——吴宪

在福林和本尼迪克特十余年的竞争中，在福林对测血糖法的研究中，还有一位中国生化学家的身影，那就是Folin-Wu法的中的“Wu”——吴宪。1919年，吴宪与福林发表了Folin-Wu测血糖法的雏形。但随后，本尼迪克特即对这种方法表示了质疑与批评。吴宪考虑到福林与本尼迪克特的关系，他针对本尼迪克特的批评，独立研究出了改进方法。当他把研究成果拿给福林时，福林激动地说，“这值得第二个博士学位”。

福林与吴宪完善后的Folin-Wu法成为了临床血糖检测史上最基础、最重要的一项方法，被广泛用于全世界的临床实验室长达50年之久。直至20世纪60年代，在美国临床化学标准方法（Standard Method of Clinical Chemistry）中“Folin-Wu法”和“Nelson Somogyi法”还被同时推荐。

吴宪虽然曾在福林指导下攻读博士学位，但实际上是福林的合作者。他不仅主导设计了钨酸滤血法，制作出了无蛋白滤液，还在1920年独自改进了Folin-Wu法。由其参与设计的Folin-Wu式血糖管至今仍在生化实验室中使用，而这仅仅是他辉煌学术生涯的开端。

吴宪从哈佛毕业后，义无反顾地选择了回国。他任职于北京协和医学院（图5），参与创建了生物化学系。

图5 吴宪

1924年，他晋升为襄教授（Associate Professor）并成为该校的第一位中国籍系主任，同时他也成为协和有史以来最年轻的系主任，任期长达18年。吴宪于1931年发表了关于蛋白质变性理论的论文，成为世界上第一位提出蛋白质变性原理的科学家。不仅如此，他带领的团队于1925～1945年间先后在英文版的《中国生理学会会志》(Chinese J.physiol.)和美国《生物化学会志》(J.Bio1.Chem.)发表了关于蛋白质变性方面的论文16篇以及相关论文14篇。

吴宪的关注点不仅聚焦于科学界，他更是用科学家的眼睛关注着国家的发展和人民生活。回国后的他意识到：对于当时的中国来说，科学强国不能仅停留在实验室里。人们更迫切需要通过科学的手段来改善生活水平，提高生活质量，摘掉所谓“东亚病夫”的帽子。就职协和后，他便着手开展营养学研究。

吴宪由食物结构与人体健康的关系入手，开始研究素膳和荤素膳的营养价值。他以简明准确的实验结果，强有力地推翻了西方世界对亚洲人身材矮小的错误认识，证明了亚洲人的身高矮小并非是先天性不可变的。在此基础上，他继续深入研究，编著了我国第一部《食物成份表》，并领导了第一次营养普查，还为不同的人群设计了特定的营养目录。

吴宪是名副其实的中国营养学的奠基者，他不受固有传统观念的限制，客观分析中国传统的饮食习惯，去其糟粕，引入西方科学标准。美国的中国史专家詹姆斯·里尔登－安德森（James Reardon-Anderson）评价吴宪是“中国化学的巨人”，“20世纪前半叶中国最伟大的化学家，或者说是最伟大的科学家”。

吴宪求学和工作过的两所机构以相似的方式纪念着他：哈佛大学医学院设立了一间以“Folin-Wu”命名的研讨室，而北京协和医学院在生化系建系100周年之际，以吴宪的名字命名了新的科研大楼（图6）。